Tohumluk Miselin Elde Edilmesi

mantar miseli

Tohumluk Miselin Elde Edilmesi
1. Misel Üretiminin Önemi ve Gelişmesi
Daha önce de belirttiğimiz gibi mantarlar çiçeksiz bitkilerdir. Dolayısıyla tohumları yoktur. Üretimleri miselleri sayesinde gerçekleştirilir. Mantar yetiştiriciliğinde, değişik maddeler üzerine sardırılarak geliştirilen sekonder miseller kullanılır.

Bu biçimde hazırlanmış misellere spawn veya tohumluk misel adı verilmektedir. Zira tohumluk, tohumdan farklı bir kavram olup üretimde kullanılan generatif veya vegetatif bitki parçalarını kapsar. Böylece tohumluk misel çoğaltma amacıyla hazırlanan ve üretimde kullanılacak olan, hububat daneleri veya bazı organik maddelere sardırılmış sekonder miselleri ifade etmektedir.

Mantarın tanınmasının ve değerlendirilmesinin hayli eski olmasına karşın; mantar miseli üretimi, ancak Mantarın özel koşullarda yetiştirilmeye başlamasından sonra gerçekleşebilmiştir. İlk aşamada mantar yıkama suyunun gübre üzerine serpilmesi ve mantar oluşturması ile yetiştirilmiştir. Kuşkusuz bu uygulamanın anlamı bilinmeden yapıldığı bir gerçektir. 19. Yüzyılınn ikinci yarısından itibaren mantar sporlarının çimlendirilmesi yolluyla misel elde edilmesi ve bu misellerin üretimde kullanılması gerçekleşmiştir. 1894 yılında Paris’te Pasteur Enstitüsünde ilk kez steril koşullarda tohumluk mantar miseli üretilmiş, bunu A.B.D’de doku kültürü yöntemleri ile tohumluk misel elde edilmesi izlemiştir. Doku kültürü ile misel üretilmesinde, sterilize edilen ahir gübresi üzerine mantar dokusu parçaları bulaştırılmış, parçalardaki miseller ahir gübresi içinde geliştikten sonra normal aşılamada kullanılmıştır.

Tohumluk misel üretiminde son aşama misellerin hububat daneleri üzerine sardırılması olmuştur. İlk kez 1931 yılında Amerikalı Sinden, mantar misellerini buğday ve çavdar tohumları üzerine sardırarak geliştirmiştir. Bu biçimde hazırlanan tohumluk miselin en önemli iki yararlı yani, aşılamada kolaylık sağlayarak el emeğini azaltması ve ayrıca misellerin kompostun her yanına eşit miktarda yayılmasına olanak vermesidir. O nedenle hububat danelerine sardırılmış misel günümüzde dünyanın her yanında yaygın olarak kullanılan tohumluk misel haline gelmiştir.

2. Misellerin Elde Edilmesi, Çoğaltılması ve Tohumluk Miselin Hazırlanması
Tohumluk miselin temizliği ve kalitesi mantar yetiştiriciliği açısından büyük öneme sahiptir. Zira kültürün geleceği, kullanılan tohumluk misele bağlıdır. Miselin yalnızca steril koşullarda hazırlanması ve temiz olması yeterli bir özellik değildir. Tohumluk misel ayni zamanda çeşidin kendine özgü özelliklerini de bünyesinde yani genotipinde taşımalıdır.

Temizliğin sağlanması için, misel üretimi sırasında steril koşulların bulunması ve korunması gerekir. Kuru ortamda yabancı ve zararlı organizmaların gelişmesinin azalacağı unutulmamalıdır. Bu nedenle laboratuvar zaman zaman steril hava ile havalandırılmalı ve nemden olduğunca kaçınılmalıdır. Nem arttıkça mikroorganizma üreme şansı artar. Genelde haftada bir defa, havada ve çevredeki mikroorganizma sayısı ve çeşidi kontrol edilmelidir. Bunun için petri kutusunda steril ağar ortamı hazırlanmalı ve kutu misel aşılama ünitesinde açılmalı, 20 dakika bekletip, kapatılmalı, sonra inkubasyon dolabında 24-25°C’de gelişmeye bırakılmalıdır. Herhangi bir organizma üremesi söz konusu olmazsa, oda havası temizdir. Olursa neyin ürediği ve ne miktar ürediği saptanıp, ona göre ilaçlama ve sterilizasyon gerçekleştirilmelidir. Ayrıca laboratuvarda çalışan personelin beden ve giysi temizliğine özen gösterilmelidir. Çalışmaya başlamadan önce yıkanmalı ve temiz elbiseler giyilmelidir. Özellikle kültür ve kompost yapımı bölümlerinde çalışanlar veya o bölümleri gezenler hiçbir şekilde misel laboratuvarına sokulmamalıdırlar.

Tohumluk misel hazırlanması üç ana bölümü kapsamaktadır. Bunlardan birincisi anaç mantarların seçimi ve sporların elde edilmesi, ikinci ana kültürlerin hazırlanması, üçüncüsü de ana kültürler yardımıyla misellerin hububat daneleri veya diğer materyaller üzerine sardırılarak tohumluk misellerin elde edilmesidir.

2.1.Anaç Mantarın Seçimi ve Sporların Elde Edilmesi
Anaç Mantarın seçimi, üretimi yapılacak çeşidin genç ve sağlıklı kültürlerinin ilk dalgalarından yapılmalıdır. Seçilen mantarlar çeşidin tipik özelliklerini göstermelidir. Bu amaç için gelişmekte olan mantarlar kontrol altına alınır. Hastalıksız, şapkalı geniş ve geç açılan, kısa saplı, kalın meyve etine sahip mantarlar işaretlenir. Seçilen mantarların hasır şapkanın saptan ayrılacağına yakın bir zamanda yapılmalıdır. Şapkanın tam büyüklüğünü aldığı anda seçilen 2-5 adet mantar koparılıp laboratuvara getirilir. Önce toprakları temizlenen mantarların, daha sonra sapları 1 cm uzunluk kalacak şekilde kesilir. Böylece hem şapka kısmı daha dengeli bir yapı kazanır, hem de transpirasyon alanı azaltılır. Mantarların tüm diş yüzeyleri bir alkollü pamuk yardımıyla silinir ve hızla alevden geçirilerek temizlenir. Diş yüzeylerin dezenfeksiyonu için kullanılan diğer yöntemlerde vardır. Mantarların 5-10 dakika kadar %1’lik potasyum permanganat eriğinde tutulması veya % 70’lik alkole daldırıldıktan sonra alkol tümüyle yanıncaya kadar alevde tutulması bunlara ait iki örnektir.

Dezenfekte edilerek hazırlanan mantarlar daha sonra temiz bir beyaz karton veya temiz bir beyaz karton veya temiz bir cam üzerine, sap ve lameller aşağıda gelecek şekilde yerleştirilir. Hava akımını engellemek ve aseptik koşulları sürdürmek amacıyla üzeri temiz bir cam fanusla kapatılır. Normal oda sıcaklığında birkaç gün sonra şapka kendiliğinden açılır ve lameller görülür. Lamellerin üzerinde oluşan olgun sporlar cam veya karton üzerine dökülmeye başlar. 18-19°C’de bırakılan mantarlar oldukça bol spor bırakmaktadır. karton veya cam üzerinde siyah kahverengi bir iz meydana getiren sporlar bir suluboya fırçası yardımıyla toplanıp steril cam kaplara konur ve kapların ağzı kapatılır. Elde edilen sporlar taze olarak kullanılabileceği gibi uzun süre saklandıktan sonra da çimlendirilebilirler. Kuru ve serin bir yerde mantar Sporlarının altı ay canlı kalabildiği bildirilmektedir. Sporlar soğukta muhafaza edildiğinde bu süre birkaç yıla kadar çıkabilir. Mantar Sporlarını 5-8°C’lerde 4 ay, 3yıl ve 6 yıl boyunca saklanabilir ve ürün alınabilmektedir. Sporların çimlenmeye almadan önce virüslere karşı savaş açısından sıcaklığa maruz bırakılmalarında yarar vardır. Bu amaçla kapalı petri kapları içine dökülen sporlar bir saat süreyle 70°C’de tutulurlar. Bu süre sonunda normal olarak virüsler inaktive edilmişlerdir. Ancak emin olmak için kontrol testi yapılabilir. Bu amaçla sporlar halinde buğday agar ortamı petri kaplarına ekilir ve kapların bir kısmı 20°C’de diğer bir kısmı da 30°C’de bulunan çimlendirme kaplarına yerleştirilir. Sporlarda virüs yoksa, bütün kaplarda çimlenme ve misel gelişimi aynıdır, fakat 20°C’de biraz daha hızlıdır. Eğer virüs varsa 30°C’de virüs bastırıldığından gelişme daha çabuk, buna karşılık 20° C’de daha yavaştır. Almanya’da Hamburg volksdof’daki Max Planck Enstitüsünde virüs testleri bu yöntemle yapılmaktadır.

2.2. Sporların Çimlendirilmesi ve Ana Kültürün Hazırlanması
Sporların çimlendirilmesi ve misel elde edilmesi özel besin ortamları üzerinde ve steril koşullarda yapılır. Besin ortamının katılığını sağlamak için agar kullanılır. Besin kaynağı olarak da şeker ,pepton veya diğer organik maddelerden yararlanılır. Bazı mantarların sporları kolay çimlendiği halde diğer bazılarınınki sorun yaratır. Bazı durumlarda ortama o Mantarın misellerinden veya bazı kimyasal maddelerden katmak gerekebilir. Örneğin bal ve kloroformun Agaricus macroporus’ta çimlenmeyi 8 gün kısalttığını bildirmektedir.

Ortamlara Sporların ekimi yine steril bir yerde yapılır. Ekimi için şişelerin ağzı açılır ve hafifçe alevden geçirildikten sonra, yakılmış bir platin uçlu iğne ile alınan sporlar besin ortamı üzerine zig-zag yapılarak bırakılır. Ekimden sonra şişenin ağzı yeniden alevden geçirilir ve pamuk tıpa ile kapatılır.

Ekim yapılan şişeler, Sporların çimlenmesi için 20-25°C sıcaklıktaki çimlendirme dolaplarında ve karanlıkta bırakılırlar. Sporların çimlenmesi için en elverişli sıcaklık düzeyi 22°C’dir. Çimlendirme süresi 21-30 gündür. Bu süre sonunda Sporların çimlenmesiyle miseller gelişmeye başlar. Gelişen miseller yeni malt-agar ortamları üzerine aşılanarak ana kültürler çoğaltılır.

Hem Sporların çimlendirilmesi, hem de ana kültür için çoğaltılması için kullanılan başka besin ortamları da mevcuttur. Örneğin; buğday-agar, yulaf-agar, patates dekstroz agar, bira mayası agar,havuç-glikoz agar, kompost agar gibi. Malt-agar ortamından sonra en fazla kullanılan besin ortamı olan buğday-agar’ın hazırlanışı da şöyledir: 125gr buğday tartılarak 4 lt saf su içerisinde iki saat kaynatılır ve 24 saat bekletilir. Bu süre %2 oranında agar katılarak kaynama noktasına kadar ısıtılır ve daha sonra otoklavda 120°C’de 20 dakika tutularak sterilize edilir. Bu şekilde hazırlanan ortamlar özellikle ana kültür misellerinin çoğaltılmasında başarılı sonuçlar vermektedir (Günay ve abak 1975).

Sporların ekilmesinde tekli spor yöntemi veya çoklu spor yöntemi kullanılır. Agaricus bisporus türünün Sporlarının her biri teorik olarak tek başına verimli misel meydana getirebilir. Çünkü çoğunlukla diploiddirler. Çoklu spor aşılaması daha çok ıslah amacı ile yapılır. Farklı sporlardan meydana gelen hiflerin birleşmesi ile oluşan misellerden böylece değişik karakterler taşıyan yeni çeşitler elde edilebilir. Spordan misel elde etme yanında dokulardan saf kültür elde ederek vegetatif çoğaltmada yapılabilir. Her ne kadar bazı araştırıcılar doku kültürü ile elde olunan misellerle yapılan üretimde verim düşüklüğü görüldüğünü belirtmekte iseler de, bunun tersini savunan yazarların sayısı da az değildir.

2.3.Tohumluk Miselin Hazırlanması
İster spordan isterse dokudan meydana gelmiş olsun, elde edilen ana kültür şeklindeki miseller daha sonra kompost veya buğdaygil tohumları üzerinde geliştirilerek tohumluk misel elde edilir. Hububat tohumu olarak, buğday, çavdar, darı ve süpürge otu tohumları kullanılır. Hangi tohum kullanılırsa kullanılsın tohumluk misel elde etme şekli aynıdır. O nedenle aşağıda örnek olarak en fazla kullanılan buğday üzerinde hazırlanmış tohumluk miselin yapımı anlatılmıştır.

Bunun için 10 kg buğday sıcak su içerisinde 15-30 dakika kaynatılır. Sonra eleklere ve süzgeçli kovalara konarak suyu iyice süzülür. Buğday danelerinin üstü havada kurutulur. Buğday danelerinin kaynatılması zorunlu değildir. Ancak kaynatılmıyorsa buğdaylar ilkin 12-20 saat süreyle su içerisinde bırakılır. Danelerin suyu iyice emmesi sağlanır. Sonra yine suyu süzülüp üstü kurutulur. Kaynatmanın veya suda bırakmanın amacı buğdayın içine su vermek, onu şişirmektir. Su verme işlemi bitince 10 kg buğdaya 50g kireç ve 200g alçı ilave edilir. Kireç ve alçı müştereken buğday daneleri ile karıştırılır. Kireç, ortamın pH değerinin 6-6.5’ta kalmasına yardım eder, alçı ise danelerin birbirine yapışmasını önler. Daha sonra 1 lt, sıcağa mukavim şişelere hacimlerinin 2/3’ü kadar buğday doldurulur. Ağzı pamuk veya alüminyum folyo ile sıkıca kapatılır. Şişeler otoklava konur ve 125-130ºC’de 1.5-2 saat süreyle sterilize edilir. Şişelerin büyüklüğü ve içine konan buğday miktarına göre süre değişebilir. Süre, otoklav istenen sıcaklığa ulaştıktan sonra tutulur. Biraz uzun süre otoklavda bırakmak, kısa süre bırakmaktan iyidir. Ancak çok fazla sıcakta ve fazla uzun süre bırakma danelerin kurumasına yol açabilir. Bu durum ileride misellerin gelişmesinin nem azlığından yavaşlamasına neden olur. İşe yerine sıcağa dayanıklı şeffaf diğer malzemelerde kullanılabilir. Süre sonunda ısıtmaya son verilir ve otoklav soğumaya bırakılır. Kapağı açılıp şişeler dışarı çıkarılır ve aşılama odasına alınır. U.V lambalar yakılır 6-7 saat sonra aşılama odasının havası tam steril hale getirilir. U.V ışınlar söndürülür. Steril hava basılarak odada basınç yaratılır ve dışardan aşılama odasına hava girmesi önlenir. Bundan sonra ana kültürden parçalar alınarak şişelere bu kültürler konur, ağızları yine kapatılır. Çalışmaya steriliteyi bozmadan devam edilir.

Şişeler aşılandıktan sonra misel geliştirme odasına yerleştirilir. Burada 20-25ºC’de, %60-70 oransal nemde 20-30 günde miseller şişeyi sarar, Ortam sıcaklığı yükseldikçe misellerin buğdayları sarma süresi kısalır. Yalnız sarmayı hızlandırmak için 10-15 gün sonra birinci, 20-25 gün sonra ikinci defa şişeler çalkalanır. Miseller şişe içine yayılır. Miseller tamamen şişe içine yayılınca aşılama odasından alınıp, kullanılacaksa saklanır yada aşılanır. Esasında böyle bir şekil misel üretimini kolaylaştırır. Çünkü ana kültür şişesi ancak 2-3 tane buğday şişesini aşılar. Oysa iyi sarmış bir dane buğday şişesi 50-100 adet yeni şişeyi aşılamaya yeter.

Aşılamayı iki kişinin yapması daha uygundur. Aşılama yaparken ana kültür ve dane şişesinin ağzındaki pamuk ve şişe ağızları, aleve tutulmalı ve aşılamadan sonra yine alevden geçirip kapatılmalıdır. Aşılama sırasında fazla hareketten kaçınılmalı ve konuşulmamalıdır. Eğer aşılamada misel sardırılmış şişeler kullanılacaksa bu şişeler önceden sallanıp içindeki buğday topakları parçalanmalı ve dağıtılmalıdır. Temiz çalışılmadığı ve bulaşma olduğu zaman aşılamadan 2-3 gün önce bilhassa penicillum’lar yeşil renkleri ile şişe içindeki buğdaylar üzerinde çabucak görülürler. Bunun dışında Aspergillum, mucor ve fusarium türleri de bulunabilir.1. hafta içinde de şişe içinde sulanmayla beraber bakteri enfeksiyonları kendini belli eder. Bu tip enfeksiyonlu şişeler hemen ortamdan uzaklaştırılmalı, laboratuvardan uzak bir yerde boşaltılıp yakılarak imha edilmelidir. Değişik mantar çeşitlerinde misellerin maksimum depolama süresinin farklı olduğu çok sayıda yapılmış araştırmalarla ortaya konmuştur. Tohumluk miseller normal oda şartlarında bir haftadan fazla saklanamaz. En iyi saklama sıcaklığı 2-4ºC’dir. Krem renkli çeşitlerin miselleri 2ºC’de iki ay depolama sonucu canlılığını kaybederken, beyaz renkli çeşitler 6 aydan fazla sürede bile rahatlıkla saklanabilirler. Sıvı azot içinde -160ºC’de miseller iki sene muhafaza edilmiş, bu süre sonunda ürün verme kabiliyeti kaybolmamıştır. Tohumluk miseller kuru olarak da çok uzun süre saklanabilir.

Karşılaştırmalı verim denemelerinde, uzun süre saklanan misellerin veriminde düşme olduğunu belirleyen araştırıcılar yanında, herhangi bir farklılık olmadığını belirtenler de vardır. Optimal depolama süresi bu yüzden 20-30 gün olarak kabul edilir. Nakliye sırasında da miseller canlılığını yitirebilirler. Çoğu kez kızışma meydana gelir. Taşıma sırasında miseller takviye edilmiş kağıt torbalar ve karton kutular içine veya şişelere konulmalıdır. Mantar miseli üreten firmaların, ürettikleri misellerin verim kontrollerini yapmaları gerekir. Bunun içinde normal mantar üretim substratına dört tekrarlamalı aşamalar yapılır. Tohumluk misel bu denemelerden sonra piyasaya sürülür. Dane tohumluk miseli geniş çapta kullanılmasına karşılık, son yıllarda yeniden substrat tohumluk misel mantar üretiminin alt yıllarında en çok kullanılan şekil idi.

Tohumluk misel üretiminde kullanılacak substratın hazırlanışı aslında normal mantar yetiştirilmesinde kullanılan kompostundakine benzemekle birlikte bazı ayrıcalıkları da vardır. Kompost, at gübresi veya buğday sapıyla hazırlanır. 1. Fermantasyona uğratılır. Normal kompost misel üretimine uygun değildir. İçinde suda çözünmüş veya serbest halde amonyak bulunabilir ve amonyak misel gelişmesini önler. Bu nedenle tohumluk misel üretiminde kullanılacak kompostun fermantasyondan sonra laboratuvarda uzun süre yıkanması ve amonyağının giderilmesi gerekir. Tohumluk misel yapımında kullanılacak iyi bir kompost kahverenginde, kırılgan fakat elastik olmalı, amonyak kokusundan arinmiş bulunmalıdır. Elle sıkıldığında su damlamamalı nem oranı %55-60 arasında olmalıdır. Bu amaçla kompost preslenip fazla suyu akıtılır. Böylece hazırlanan kompost ya hububat danelerinde olduğu gibi şişelere konulup otoklavda sterilize edildikten sonra misel aşılamasında kullanılır, Ya da plastik torbalarda paket halinde tohumluk misel yapılır. İkinci durumda kompost önce 4-5 cm genişlikte 20 cm uzunlukta kaplarin içine preslenir, kapların ağzı kapatılır ve otoklavda sterilize edilir. Otoklavdan çıkarılan ve soğutulan kompost, kaplardan plastik torbalara alınır ve aşılanır. Torbaların ağzı preslenerek 20-25ºC arasındaki geliştirme odasına yerleştirilir. 6-8 hafta içinde miseller ortamı iyice sarar ve tohumluk misel elde edilir. ( Kaynak: Mantar Yetiştiriciliği Kitabı Prof. Dr. Atila GÜNAY )

Click to rate this post!
[Total: 1 Average: 5]
(Visited 28 times, 1 visits today)

Alakalı yazılar

Leave a Comment